The Korean Journal of Food and Cookery Science
[ Research Articles ]
Korean Journal of Food and Cookery Science - Vol. 34, No. 4, pp.342-349
ISSN: 2287-1780 (Print) 2287-1772 (Online)
Print publication date 31 Aug 2018
Received 22 Jun 2018 Revised 16 Aug 2018 Accepted 16 Aug 2018
DOI: https://doi.org/10.9724/kfcs.2018.34.4.342

7종 발효 약재 혼합물의 산화방지 및 유지산화안정성 효과

김민아 ; 한창희 ; 정아영 ; 김현숙1 ; 김미자
강원대학교 보건과학대학 식품영양학과
1㈜우리엘바이오
Antioxidative Effect of Seven Fermented Medicinal Herb Mixtures Using in Vitro Assays and Bulk Oil System
Min-Ah Kim ; Chang Hee Han ; A Young Jeong ; Hyun Sook Kim1 ; Mi-Ja Kim
Department of Food and Nutrition, Kangwon National University, Samcheok 25949
1Woori El Bio, Ltd., Pyeongtaek 17719

Correspondence to: Mi-Ja Kim, Department of Food and Nutrition, College of Health Science, Kangwon National University, 346, Hwangjo-gil, Dogye-eup, Samcheok-si, Gangwon 25949, Korea Tel: +82-33-540-3313, Fax: +82-33-540-3319, E-mail: mijakim@kangwon.ac.kr


© 2018 Korean Society of Food and Cookery Science
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Abstract

Purpose

Seven fermented medicinal herb mixtures were made by fermenting Buckwheat, Solomon's seal, mate, Job's tears, Angelica, Goji berry, and Gastrodia elata Blume in proportions. This study examined the antioxidant activity and oxidative stability of seven fermented medicinal herb mixtures.

Methods

The antioxidant capacity of an 80% ethanol extract of the seven fermented medicinal herb mixtures was determined by the DPPH radical scavenging activity, ABTS cation radical scavenging, FRAP value, ORAC assay, total flavonoid contents (TFC), and total phenolic contents (TPC). The conjugated diene and ρ-anisidine value were used to evaluate the oxidative stability.

Results

The DPPH and ABTS radical scavenging activity at 0.25, 0.50, 1.00 mg/mL were 34.1, 57.2, 89.2 and 67.4, 95.7, 98.4%, respectively. The FRAP value was 455.8 μM ascorbic acid equivalent/g extract. The TFC and TPC were 32.4 μM quercetin equivalent/g extract and 40.2 μM tannic acid equivalent/g extract, respectively. Furthermore, the total phenolics showed positive correlations with the DPPH radical scavenging activity, ABTS cation radical scavenging, FRAP value, and ORAC assay (p<0.01). In addition, the amounts of conjugated diene and the ρ-anisidine value produced by lipid oxidation in the bulk oil system were reduced significantly compared to the control oil (p<0.05).

Conclusion

These results suggest that the ethanol extract of seven fermented medicinal herb mixtures has excellent antioxidative activity and oxidative stability in bulk oil and can be used as natural antioxidants.

Keywords:

seven fermented medicinal herb mixtures, antioxidant activity, bulk oil system, oxidative stability

Ⅰ. 서 론

불규칙한 식생활 및 극심한 스트레스 등으로 인해 현대인들은 만성 질환 발병률이 증가하고 있다. 라디칼과 같은 물질이 체내에 부정적인 영향을 주어 질병을 초래할 수 있는데 이를 제거할 수 있는 산화방지제에 관한 활발한 연구가 진행되고 있으며, 또한 안전하고 우수한 효과를 지닌 천연물에 대한 연구가 요구된다(Seo EJ 등 2010).

메밀(Fagopyrum esculentum)은 쌍자엽 식물의 마디풀과에 속하는 일년생 초본으로 단메밀이라고 부른다(Kim JK & Kim SK 2005). 이는 혈관의 투과성을 감소시켜 고혈압과 동맥경화를 억제하는 효과가 있다고 알려져 있는데, 루틴(rutin)과 퀘세틴(quercetin)을 많이 함유하고 있어 건강식품으로 주목을 받고 있다(Kwak CS 등 2004). 둥굴레(Polygonatum odoratum)는 백합과에 속하는 다년생 초본인 식용작물로 전분, 탄수화물, 아미노산, 알칼로이드 등의 성분을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 당뇨, 갈증해소, 혈압저하, 혈당저하 등의 효과가 있다(Kim KT 등 2005). 의인(Coix lachryma-jobi)은 화본과 일년생 초본으로 율무라고도 부르며, 이는 혈중 중성지방을 감소시키며 HDL 콜레스테롤을 증가시켜 심혈관계질환을 저해한다(Park TS 등 2009). 마테(Ilex paraguariensis)는 감탕나무과에 속하며 이는 남아메리카 지역에서 차로 우려 음용되며, 이뇨작용, 항산화작용, 심혈관계질환, 항비만에 효과가 있다고 알려져 있다(Lee SJ & Jee CH 2016). 천마(Gastrodia elata Blume)는 난초과에 속하며 gastrodine이 주된 성분으로, 이는 항산화, 항비만, 항염증 등의 활성을 나타낸다고 보고 되었다(Kim MH 2014). 당귀(Angelica gigas)는 미나리과에 속하며 항산화력, 면역 등에 관한 연구가 이루어지고 있고(Jeong HJ 등 2010), 구기자(Lycium chinense)는 가지과에 속하며 베테인(betaine), 제아잔틴(zeaxanthin) 등의 성분을 포함하고 있다. 지용성 성분인 제아잔틴은 유지용매에 추출되며 항산화, 항염증, 콜레스테롤 저하 등의 효능을 나타낸다고 알려져 있다(Kim HK 등 2004). 또한, Cho EK 등(2010)은 이러한 혼합 약용작물의 체내 흡수율을 높일 수 있는 방법으로 발효 공정을 추가하여 항산화 활성 증가 및 항염증 개선에 관한 보고를 한 바 있다.

이와 같이 우수한 생리활성 기능이 있는 약용작물은 단독으로 사용하더라도 우수한 효능을 나타낼 수 있으나, 이들을 혼합하였을 때 나타날 수 있는 상승효과 및 혼합 사용시 생리활성물질의 체내 흡수율을 높일 수 있는 방법에 대한 연구도 필요하다고 사료된다.

따라서 본 연구에서는 플라보노이드, 페놀산, 토코페롤 등이 포함되어 있어 산화방지 효과, 혈압, 항당뇨에 효과가 있는 메밀을 주요 물질로, 둥굴레, 의인, 마테, 천마, 당귀, 구기자를 생리활성물질의 함량을 높일 수 있는 방법인 발효를 이용하여 각각 발효시켜 혼합한 혼합물을 제조하였다. 제조한 혼합물을 80% 에탄올로 추출하여 산화방지 효과 및 bulk oil system에 적용하여 유지 산화안정성을 평가하여 항산화 기능성 소재 및 유지의 산화를 지연시킬 수 있는 소재로의 가능성을 평가해 보고자 하였다.


Ⅱ. 재료 및 방법

1. 7종 발효 약재 혼합물 및 에탄올 추출물 제조

7종 발효 약재 혼합물은 ㈜우리엘바이오(Pyeongtaek, Korea)로부터 제공받았으며, 제조방법은 다음과 같았다. 메밀(60%), 둥굴레(10%), 의인(5%), 당귀(5%), 구기자(5%), 천마(5%)는 전라북도 진안군 주천면 무릉리 농가에서 직접 구입하였고, 마테(10%)는 브라질산으로 경동시장(Seoul, Korea)에서 구매하였으며, 각각을 계량하여 1차 세척 후 18°C의 정수물에서 20분간 방치하여 2차 세척하고 40°C 온도에서 24시간 동안 건조하였다. 그 후 다시 18°C의 상온에서 침출 후 70°C에서 12시간 동안 각각 저온 추출하고 액상만을 분리하였다. 분리한 액상에 효모 추출물(Angel, Shanghai, China), 포도당(Daesang, Seoul, Korea), 프락토 올리고당(CJ Cheiljedang, Seoul, Korea)을 5%가 되도록 첨가하여 살균하였다. 그 후 각 원료별 유산균을 접종하였는데 메밀은 Lactobacillus acidophilus, 둥굴레는 Lactobacillus plantarum, 의인은 Lactobacillus casei를 사용하였으며, 마테는 Lactobacillus rhamnosus, 당귀는 Bifidobacterim longum, 구기자는 Bifidobacterium lactis, 천마는 Bifidobacterium breve를 사용하였다. 5일간의 발효 후에 잔여 당분 및 탄산가스를 제거하는 과정을 거쳐 7종 발효 약재 혼합물을 얻었다. 이러한 혼합물을 20 g 취하여 이에 5배의 80% 에탄올(Daejung, Siheung, Korea)을 용매로 교반기(PC 420, Corning, NY, USA)를 이용하여 4시간 진탕하여 추출하였으며 얻어진 추출물은 Whatman No. 2 여과지로 여과하여 40°C water bath(Rotavapor®R-100, BŰCHI, Zollikofen, Switzerland)에서 rotary vacuum evaporator(BŰCHI)를 이용하여 감압농축을 실시하고 동결건조(BFD85-F8, Ilshin-Biobase, Seoul, Korea)하여 얻어진 시료를 -20°C에서 보관하며 사용하였다.

2. DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능 측정

7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 메탄올(Daejung, Siheung, Korea)을 이용하여 0.1 mM DPPH(Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액으로 제조하여 사용하였다. DPPH 용액 0.75 mL와 0.25, 0.5, 1.0 mg/mL의 농도로 희석한 시료 용액 0.25 mL를 각각 넣어 30분간 암소에서 반응시켜 DPPH 라디칼의 보라색이 감소하는 정도를 517 nm에서 UV/VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다(Blois MS 1958). 대조군은 메탄올을 이용하여 추출한 시료 용액과 동량 처리하여 같은 과정으로 실시하였다.

Inhibition rate% =Ac-AsAc×100
Ac : 대조군 흡광도
As : 시료의 흡광도

3. ABTS(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)) 양이온 라디칼 소거능 측정

ABTS 양이온 라디칼 소거능은 증류수를 이용하여 7 mM ABTS(Sigma)와 2.45 mM potassium persulfate(Sigma)를 용해하여 1:1(v/v)로 혼합한 용액을 제조하였다. 이를 12시간 방치하여 ABTS 양이온 라디칼이 형성되도록 하였으며, 그 후 734 nm 파장에서 UV/VIS spectrophotometer(Scinco)를 이용하여 흡광도가 0.70±0.05가 되도록 에탄올로 희석하였다. 희석한 ABTS 용액 0.95 mL와 0.25, 0.5, 1.0 mg/mL 농도로 희석한 시료 0.05 mL를 넣어 암실에서 6분간 반응시켜 734 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다(Fellegrini N 등 1999).

Inhibition rate% =Ac-AsAc×100
Ac : 대조군 흡광도
As : 시료의 흡광도

4. Ferric reducing antioxidant power (FRAP) 측정

증류수를 이용하여 300 mM sodium acetate(Sigma)를 용해시킨 후 pH 3.6이 되도록 acetic acid(Daejung)로 조정하였다. 증류수로 희석한 40 mM HCl(Daejung)을 이용하여 10 mM 2,4,6-tripyridyl-S-triazine(Sigma)이 되도록 제조하였다. 또한 증류수를 이용하여 20 mM FeCl3(Sigma)을 용해하여 사용하였으며, 제조한 용액은 각각 순서대로 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합한 후 37°C에서 15분간 평형시켜 FRAP 시약을 제조하였다. FRAP 시약 0.9 mL와 적정 농도로 희석한 시료 0.03 mL를 넣어 준 후 암실에서 30분간 반응시켰다(Benzie IFF & Strain JJ 1996). 반응 후 UV/VIS spectrophotometer(Scinco)를 이용하여 593 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. FRAP 환원력은 표준물질로 ascorbic acid(Sigma)를 이용하여 농도별로 증류수에 희석한 후 검량곡선을 작성하여 정량하였다.

5. 총 플라보노이드 함량

증류수로 용해한 시료 0.1 mL와 에탄올 0.3 mL를 혼합 후 증류수에 녹인 10% aluminum chloride(Sigma) 0.02 mL를 넣어주었다. 그 후 증류수 0.56 mL와 증류수에 용해한 1 M potassium acetate(Sigma) 0.02 mL를 넣어 30 분간 반응시켰다(Chang CC 등 2002). 그 후 UV/VIS spectrophotometer(Scinco)를 이용하여 415 nm 파장에서 측정하였으며, 표준물질로 quercetin(Sigma)을 이용하여 농도 별로 증류수에 희석하여 검량곡선을 작성하여 정량하였다.

6. 총 페놀함량

7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 총 페놀함량은 Folin-Denis법을 이용하여 측정하였다(Folin O & Denis W 1912). 증류수에 용해한 시료 용액 0.05 mL와 증류수 0.8 mL를 섞은 후 Folin-Denis' reagent(Sigma) 0.05 mL를 첨가하여 혼합한 후 5분간 반응시켰다. 그 후 증류수에 포화된 sodium carbonate(Sigma) 0.1 mL를 첨가하여 30분 간 정치하여 UV/VIS spectrophotometer(Scinco)로 725 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 tannic acid(Sigma)를 증류수에 용해하여 각 농도별로 희석하였으며, 이를 이용하여 검량곡선을 작성한 후 정량하였다.

7. Oxygen radical absorbance capacity(ORAC) assay

7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물을 75 mM phosphate buffer(Wako, Osaka, Japan)에 0, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 용해하여 시료로 사용하였다. 1 μM fluorescein salt(VWR, Radnor, PA, USA)가 되도록 동일한 buffer에 녹여 37°C 항온수조(BS-21, Jeio Tech, Daejeon, Korea)에서 평형시켜 사용하였으며, 2,2′-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride(AAPH)(Wako)는 300 mM이 되도록 동일한 buffer를 이용하여 peroxy radical을 생성시켰다. 이들을 순서대로 50, 150, 50 μL를 넣은 후 형광물질의 발광정도를 37°C 온도를 유지하며 493 nm에서 전자가 여기 되며, 515 nm 파장에서 방출되도록 측정하였다(Ou B 등 2001). 대조군으로는 추출 시료 용액과 동량의 75 mM phosphate buffer(Wako)를 사용하였다. 표준물질로는 trolox(Sigma)를 사용하였으며, 75 mM phosphate buffer에 녹여 fluorescence microplate reader(Gemini XPS, Molecular devices, St. San Jose, CA, USA)에서 동일한 파장으로 측정하였다.

8. 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물 첨가 유지 제조

7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물을 dimethyl sulfoxide(Daejung)에 완전히 녹일 정도만 소량 첨가하여 녹인 후 옥수수유(CJ Cheiljedang)에 200 ppm이 되도록 첨가하였다. 대조군으로는 옥수수유에 동량의 dimethyl sulfoxide(Daejung)를 처리하여 사용하였다. 이를 100±5°C의 dry oven(J-DV02, Jisico, Seoul, Korea)에서 3, 6, 9시간 동안 열산화시켰다. 잔열로 산화되는 것을 방지하기 위해 oven에서 꺼낸 직후 -20°C에서 보관하며 실험을 진행하였다.

9. Conjugated dienoic acid(CDA)가

유지를 산화시킨 시료 100 mg을 isooctane(Daejung) 25 mL에 분산시켜 흡광도 값이 적정범위로 들어오도록 isooctane을 이용하여 희석하였다(AOCS 1980). 그 후 UV/VIS spectrophotometer(Scinco)로 233 nm 파장에서 석영셀을 이용하여 흡광도를 측정하였다.

10. ρ-Anisidine value(ρ-AV) 법

ρ-AV는 산화된 유지시료 100 mg을 25 mL의 isooctane에 분산시켜 준비하였다. 그 후 acetic acid를 이용하여 0.25% ρ-anisidine(KantoChemical, Tokyo, Japan)이 되도록 제조하여 시료 1 mL와 제조된 용액 0.2 mL를 넣어 혼합 후 암실에서 15분간 반응시켰다(AOCS 1990). 반응 후 UV/VIS spectrophotometer(Scinco)를 이용하여 350 nm 파장에서 석영셀을 이용하여 흡광도를 측정하였다.

11. 통계처리

모든 실험은 3회 반복하여 결과를 얻었으며, 이는 SPSS Statisitcs(ver. 23, IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용하여 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 유의성 검정은 p<0.05 수준에서 t-test 및 one-way ANOVA로 분석하였으며, Duncan’s multiple range test를 이용하여 사후검정을 실시하였다. 상관관계지수는 피어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient)를 이용하여 유의성 검정을 실시하였다.


Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 라디칼 소거능 변화

7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 라디칼 소거능을 0.25, 0.5, 1.0 mg/mL의 농도에서 측정하였으며 그 결과는 Fig. 1과 같았다. DPPH 라디칼 소거능은 농도가 증가함에 따라 34.1, 57.2, 89.2%로 증가하였으며, ABTS 양이온 라디칼 소거능도 67.4, 95.7, 98.4%로 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하였다. Kang HW(2014)의 연구에 의하면 메밀을 열수 추출한 추출물의 DPPH 소거활성 분석 결과, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 mg/mL의 농도에서 각각 20.76, 37.11, 43.29, 50.83, 69.27, 83.58% 소거활성을 나타내었으며, ABTS의 결과는 동일한 농도에서 17.83, 22.01, 36.55, 39.87, 60.90, 66.27%로 소거활성을 보고하였다. 또 다른 연구인 Cha JY 등(2010)은 한방 생약재 40종을 추출하고 발효액으로 제조하여 DPPH 라디칼 소거능을 연구한 결과, 당귀가 61.39%로 비교적 높게 나타나 우수한 소재로 보고하였다. 본 연구에서도 메밀을 주원료로 한 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물이 농도 의존적으로 탁월한 라디칼 소거능을 보이는 것으로 관찰되었다. Cha JY 등(2011)은 영지버섯, 여주, 쓴메밀과 이들 혼합시료의 메탄올 추출물 라디칼 소거능을 비교한 결과, 0.1, 0.5, 1.0 mg/mL의 농도에서 우수한 소거능을 보였고, 이는 영지버섯, 여주의 효과보다는 쓴메밀 효과에 의한 것으로 보고하였다. 단일 쓴메밀의 항산화 효능보다도 혼합물이 더 우수한 산화방지 역할을 한다고 보고하여 약용 작물들의 단일 소재로서의 효능뿐만 아니라 이들의 혼합물에 대한 관심 또한 효능 연구의 대상이 되고 있음을 알 수 있었다.

Fig. 1.

Radical scavenging activities of 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract. Different letters are significantly different at p<0.05 among different treatment concentration of each group.

2. 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 FRAP 환원력, 총 플라보노이드 및 총 페놀함량 변화

7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 FRAP 환원력은 455.78 μM ascorbic acid equivalent/g extract로 분석되었다(Table 1). 총 플라보노이드 및 총 페놀함량은 Table 2에 나타낸 것과 같이 각각 32.43 μM quercetin equivalent/g extract와 40.17 μM tannic acid equivalent/g extract였다.

FRAP value in 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract

Contents of total flavonoid and total phenolic in 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract

Yoon BR 등(2012)의 연구에 의하면 250 μg/mL 농도의 아스코르브산과 비교하여 메밀의 80% 에탄올 추출시 1.0 mg/mL의 농도에서 아스코르브산과 비슷한 FRAP 환원력을 보였다고 보고하였다. Gu YR 등(2016)에 의하면, 산수유, 오미자, 복분자, 구기자 4종의 약용열매로부터 열수 추출한 추출물의 총 페놀함량은 tannic aicd를 이용하여 정량한 결과, 15.54 g/100 g이라고 하였으며 총 플라보노이드 함량은 rutin으로 정량한 결과, 5.65 g/100 g이라고 하였다. Cha JY 등(2011)의 연구에 의하면 쓴메밀 단일소재 및 이와 다른 약재를 혼합한 혼합물을 비교한 결과, 총 페놀함량 및 플라보노이드 함량이 단일 소재보다 혼합물일 때 더 높은 함량을 보였다고 보고하였다. 이외에도 Lee YR & Yoon NR(2015)은 율무, 둥굴레를 포함한 23종의 약재를 메탄올 추출물을 얻어 총 페놀함량을 gallic acid로 정량한 결과, 율무와 둥굴레가 각각 3.45, 4.1 mg gallic acid equivalent/g extract를 나타냈다고 보고하였다. 이와 같이 추출 조건의 차이는 있지만 각각의 추출물의 효능보다 혼합물 형태의 추출 시 더 높은 생리활성 물질의 함량을 보이는 것으로 관찰되었다. 뿐만 아니라 발효에 의한 효과 연구로는 Park SJ 등(2009)이 더덕을 이용하여 발효 전과 후의 총 페놀함량을 비교해 본 결과, 발효 전과 후에 각각 0.54, 2.79 mg/100 g으로 나타났으며 총 플라보노이드 함량의 발효 전과 후의 결과 역시 각각 2.26, 6.19 mg/100 g으로 나타나 발효 공정 후의 함량이 증가하였다고 보고하였다.

3. 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 ORAC가 변화

7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 ORAC 분석 결과는 다음 Fig. 2와 같다. Fig. 2A는 대조군 및 7 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 12.5, 25, 50, 100 μg/mL 농도처리에 의한 fluorescein의 소거를 나타낸 것이다. 결과적으로 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비해 fluorescein의 소멸을 감소시켜 우수한 항산화력을 보이는 것으로 나타났다. 이러한 효과는 표준물질인 trolox 100 μM은 2.1배, 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물 12.5 μg/mL 농도에서는 1.8배, 25 μg/mL 농도에서는 2.3배, 50 μg/mL 농도에서는 3.5배, 100 μg/mL 농도에서는 4.5배로 농도 의존적으로 증가하여 25 μg/mL 농도 이상에서는 표준물질보다 ORAC가가 유의적으로 증가함을 알 수 있었다. 이러한 발효 약용작물의 연구로 Lee JB & Kim KW(2013)는 발효 당귀 추출물을 이용하여 ORAC가를 분석한 결과, 발효 전보다 3배 이상의 산화방지 활성이 높아진 것으로 나타났다고 보고하여 발효를 하지 않은 것보다 발효를 통해 생리활성 물질의 활성이 높아짐을 보고한 바 있다.

Fig. 2.

Effect of 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract on fluorescein elimination induced by AAPH. (A) Time course of the reaction of fluorescein with AAPH in 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract (7FM) at different concentration. (B) relative area under the curve of control, trolox 100 μM, and 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract 12.5, 25, 50, and 100 μg/mL in ORAC assay. Values represent the mean±SD (n=3). Mean with different letters above a bar are significantly different at p<0.05.

4. 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 산화방지 측정법과 총 페놀함량의 상관관계 분석

7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 산화방지 측정과 총 페놀함량의 상관관계를 분석한 결과는 Table 3과 같다. 총 페놀함량과 DPPH 라디칼 소거능은 r=0.995(p<0.01), ABTS 양이온 라디칼 소거능은 r=0.850(p<0.01), FRAP 환원력은 r=0.893(p<0.01), ORAC assay는 r=0.973(p<0.01)으로 상관관계를 나타내었다. Kwak CS 등(2004)은 메밀, 수수, 기장, 율무의 총 페놀함량의 상관관계를 분석한 결과, DPPH IC50과 총 페놀함량의 결과가 음의 상관관계를 보였다고 보고하였다. 본 연구결과에서는 총 페놀함량과 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 양이온 라디칼 소거능, FRAP 환원력 및 ORAC assay모두 유의적인 양의 상관관계(p<0.05)를 보여 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 산화방지 효과는 총 페놀 함량에 의한 것으로 사료된다.

Pearson’s correlation coefficient between total phenolic contents and antioxidant assays in 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract

5. 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물 첨가에 따른 유지산화의 conjugated diene 및 ρ-ansidine value 변화

7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물을 첨가하여 100°C에서 시간의 경과에 따라 열산화 시킨 유지시료의 conjugated diene 측정 결과는 Fig. 3과 같다. 추출물을 처리하지 않은 대조군의 경우 3시간 열산화 시킨 결과, conjugated diene이 0.21%로 분석되었으며, 6시간 후에는 0.43%, 9시간 후에는 0.58%로 측정되었다. 반면 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물이 200 ppm 농도로 첨가된 군은 3시간 열산화 시 0.29%, 6시간 후에는 0.32%, 9시간 후에는 0.66%로 나타났다. ρ-Anisidine value의 결과는 Fig. 4와 같다. 시료를 처리하지 않은 대조군의 경우 3시간 열산화 시킨 결과, ρ-anisidine value가 16.6이었고, 6시간이 지난 후에는 24.9, 9시간 후에는 26.5로 나타났다. 반면 추출물을 200 ppm농도로 처리한 군은 3시간 열산화시킨 후에 16.6, 6시간 후에는 18.2, 9시간 후에는 19.4로 나타났다.

Fig. 3.

Change in conjugated dienoic acid in bulk oil with 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract at 100oC. *, **, and *** are significantly different between control and 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract (7FM) at p<0.05, p<0.01 and p<0.001, respectively.

Fig. 4.

Change in ρ-anisidine value in bulk oil with 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract at 100 oC.** is significantly different between control and 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract at p<0.01, respectively.

이와 같은 결과로 초기 산화생성물을 측정하는 conjugated diene 함량의 경우는 3시간, 6시간, 9시간 유지산화가 진행되면서 대조군에 비해 6시간에서만 유의적으로 초기 산화물의 감소가 일어났고, 이차 산화생성물을 측정하는 ρ-anisidine value의 경우는 대조군에 비해 유의적으로 3시간, 6시간, 9시간 유지산화가 진행되면서 감소하는 것으로 나타나 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물이 초기 산화생성물보다 이차 산화생성물 감소에 더 긍정적인 영향을 준 것으로 관찰되었다. 이러한 한약재에 대한 유지산화 연구 중 Park YS(2002)는 한약재 에탄올 추출물에 linoleic acid를 이용하여 thiocyanate법을 통해 지질의 산화 정도를 확인한 결과, 국화, 구기자, 감초, 작약은 가장 우수한 유도기간을 보였으며 당귀와 대추가 그 다음으로 우수하였다고 보고하였다.


Ⅳ. 요약 및 결론

본 연구는 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 산화방지와 유지 산화안정성의 효과를 확인하고자 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 양이온 라디칼 소거능, FRAP 환원력, ORAC assay, 총 플라보노이드, 총 페놀함량을 통하여 산화방지 효과를 살펴보았다. DPPH 라디칼 소거능의 결과로는 0.25, 0.5, 1.0 mg/mL의 농도에서 34.1, 57.2, 89.2% 증가하였으며, ABTS 양이온 라디칼 소거능의 경우 동일한 농도에서 67.4, 95.7, 98.4%로 유의하게 증가하였다. FRAP 환원력은 455.78 μM ascorbic acid equivalent/g extract으로 나타났으며, 총 플라보노이드 함량은 32.43 μM quercetin equivalent/g extract로, 총 페놀함량은 40.17 μM tannic acid equivalent/g extract으로 나타났다. ORAC 분석의 결과는 대조군과 비교하여 표준물질로 사용한 trolox 100 μM의 농도에서 2.1배 증가하였고, 7종 발효약재 혼합물 에탄올 추출물을 12.5, 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리한 결과, 항산화력이 각각 1.8, 2.3, 3.5, 4.5배 증가하는 것을 알 수 있었다. 유지 산화안정성을 측정한 conjugated diene은 100°C에서 6시간 산화처리에서 대조군보다 생성량이 25.6% 감소하였으며, ρ-anisidine value는 3시간, 6시간, 9시간 유지산화가 진행됨에 따라 유의적으로 이차 산화생성물 생성이 감소되어 유지 산화안정성에서 효과가 우수한 것으로 나타났다. 따라서 7종 발효 약재 혼합물 에탄올 추출물의 첨가가 산화방지 및 유지 산화안정성에 우수한 효과를 부여할 수 있을 것으로 판단된다.

Acknowledgments

This work (Grants No. C0564067) was supported by project for Cooperative R&D between Industry, Academy, and Research Institute funded Korea Ministry of SMEs and Startups in 2017.

Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

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Fig. 1.

Fig. 1.
Radical scavenging activities of 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract. Different letters are significantly different at p<0.05 among different treatment concentration of each group.

Fig. 2.

Fig. 2.
Effect of 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract on fluorescein elimination induced by AAPH. (A) Time course of the reaction of fluorescein with AAPH in 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract (7FM) at different concentration. (B) relative area under the curve of control, trolox 100 μM, and 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract 12.5, 25, 50, and 100 μg/mL in ORAC assay. Values represent the mean±SD (n=3). Mean with different letters above a bar are significantly different at p<0.05.

Fig. 3.

Fig. 3.
Change in conjugated dienoic acid in bulk oil with 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract at 100oC. *, **, and *** are significantly different between control and 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract (7FM) at p<0.05, p<0.01 and p<0.001, respectively.

Fig. 4.

Fig. 4.
Change in ρ-anisidine value in bulk oil with 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract at 100 oC.** is significantly different between control and 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract at p<0.01, respectively.

Table 1.

FRAP value in 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract

FRAP1) (μM ascorbic acid equivalent/g extract) 7 Fermented medicinal herb mixtures
455.78±4.89

Table 2.

Contents of total flavonoid and total phenolic in 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract

7 Fermented medicinal herb mixtures TFC1) (μM quercetin equivalent/g extract) TPC2) (μM tannic acid equivalent/g extract)
32.43±3.95 40.17±1.10

Table 3.

Pearson’s correlation coefficient between total phenolic contents and antioxidant assays in 7 fermented medicinal herb mixtures ethanol extract

DPPH radical scavenging ABTS cation radical scavenging FRAP assay ORAC assay Total phenolic contents
**p<0.01.
DPPH radical scavenging 1
ABTS cation radical scavenging 0.857** 1
FRAP assay 0.889** 0.880** 1
ORAC assay 0.971** 0.878** 0.970** 1
Total phenolic contents 0.995** 0.850** 0.893** 0.973** 1