The Korean Journal of Food and Cookery Science
pISSN 2287-1780 l eISSN 2287-1772 l KOREAN

Current Issues

Korean Journal of Food & Cookery Science - Vol. 34 , No. 6

[ Article ]
Korean Journal of Food and Cookery Science - Vol. 34, No. 6, pp.560-568
Abbreviation: Korean J Food Cook Sci
ISSN: 2287-1780 (Print) 2287-1772 (Online)
Print publication date 31 Dec 2018
Received 29 Sep 2018 Revised 05 Oct 2018 Accepted 15 Oct 2018
DOI: https://doi.org/10.9724/kfcs.2018.34.6.560

반응표면분석법을 이용한 아로니아 천연발효종 제조를 위한 조성 최적화
변보영 ; 채규서 ; 박희전1 ; 송지영2,
(재)베리&바이오식품연구소 연구원
1(재)베리&바이오식품연구소 팀장
2(재)베리&바이오식품연구소 실장

Optimization of Composition for Naturally Fermented Aronia Starters Using Response Surface Methodology
Bo Young Byun ; Kyu Seo Chae ; Hee Jeon Park1 ; Ji Young Song2,
Researcher, Berry & Biofood Research Institute, Jeonbuk 56417, Korea
1Team Leader, R&D center, Berry & Biofood Research Institute, Jeonbuk 56417, Korea
2Manager, R&D center, Berry & Biofood Research Institute, Jeonbuk 56417, Korea
Correspondence to : Ji-Young Song, Berry & Biofood Research Institute, 558, Bokbunja-ro, Gochang-gun, Jeonbuk 56417, Korea Tel: +82-63-560-5151, Fax: +82-63-563-6680, E-mail: jysongg@naver.com


© 2018 Korean Society of Food and Cookery Science
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creative-commons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Funding Information ▼

Abstract
Purpose

This study was conducted to determine the optimal composition for natural fementation of aronia starters using dried aronia, sugar and dried milk.

Methods

Response surface methodology with a central composite design comprising five levels and three variables was used to identify the optimal combination of dried aronia (X1), sugar (X2), dried milk (X3). The physicochemical properties, viable cell counts, leavening volumes of samples and identification of microorganisms were analyzed.

Results

Using the F-test, total titratable acidity was expressed as a quadratic model, whereas the pH, sugar brix, color L-value, a-value and lactic acid bacteria counts were a linear model, and leavening volume were 2FI model. Most strains were identified as Saccharomyces cerevisiae and Enterococcus faecium.

Conclusion

The optimum formulations determined by numerical and graphical analyses were both found to be: dried aronia 19.72%, sugar 12.44% and dried milk 1.95%.


Keywords: aronia, black chokeberry, natural fermentation, starter, response surface methodology (RSM)

Ⅰ. 서 론

아로니아(Aronia melanocarpa)는 블랙초크베리(black chokeberry)라고도 알려져 있으며(Wu X 등 2004), 북아메리카지역이 원산지로 유럽에서 많이 재배되고 있으며, 최근 국내에서도 재배가 증가되었다(Wu X 등 2004, Hwang ES & Lee YJ 2013). 아로니아는 색과 향이 좋아 주스나 잼으로 주로 가공되며(Oszmianski J & Wojdylo A 2005), 열매에는 안토시아닌 색소가 풍부하여 천연색소로의 사용이 가능하고, 폴리페놀 및 플라보노이드와 같은 파이토케미칼을 함유하고 있어 항산화 및 항염 작용(Ohgami K 등 2005), 면역조절(Gasiorowski K 등 2000) 등 다양한 기능을 가지는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 아로니아의 효능과 관련된 연구는 많이 진행되어 있으나 가공에 대한 연구는 매우 부족한 실정이다.

빵은 인류가 제조한 가장 오래된 가공 식품 중의 하나로 기원전 5,000년 경부터 만들어지기 시작한 것으로 추정된다. 빵은 발효과정 중 효모와 젖산균의 작용으로 반죽내에서 알코올 발효와 함께 젖산 발효가 일어나며 그 결과, 빵 특유의 향미를 부여하고 기호도를 증진시킨다(Danaka KB 1994). 사워도우는 자연효모를 활성화시키는 동안 공기 중 미생물이 낙하하여 발효에 관여하며 발효 후 신맛을 내는 반죽으로 상업용 효모가 시판되기 전까지 빵의 발효방법의 하나로 사용되어 왔으며 빵 제조의 스타터(발효종)로 이용되어 왔다. 최근 제빵산업은 자연친화적이고 건강지향적인 자연발효 빵에 대한 다양한 연구와 상품화가 진행되고 있으며, 똑같은 맛과 풍미를 가진 제빵용 시판효모로 발효시킨 빵보다 독특하고 뛰어난 풍미를 지닌 천연효모로 발효한 빵에 대한 소비자들의 관심이 높아지고 있다(Hong JH & Kim KJ 2001a, Hong JH & Kim KJ 2001b).

천연 발효종으로 반죽된 빵은 풍부한 향미를 가진다. 발효시 젖산균에 의해 생성되는 유기산에 의해 독특한 신맛이 나타나며 유해한 곰팡이의 생육을 억제하고, 제품의 노화 억제에 의한 저장 기간을 연장할 수 있다는 장점이 있다(Hong JH 등 2000, Lee YK 등 2001, Chung HC 2008). 천연발효종은 각 나라의 기후와 풍토에 따라서 변화될 수 있으며 사용하는 물의 온도, 발효종의 관리방법과 발효기간 등에 따라 달라지기 때문에 발효종을 만들기 위한 배합이 동일하더라도 똑같은 발효종을 만들기는 어려우므로 우리나라의 환경에 맞는 발효종을 제조하여 사용할 필요가 있다(An HL 등 2009).

천연발효종은 제조사 별로 발효종의 배합비율과 제조공정이 달라 표준화하기 어렵다는 단점이 있다. 이런 단점을 개선하고 우리 농산물에 적합한 천연 발효종을 개발하기 위한 연구로는 수입밀과 우리밀의 제빵적성 비교연구(Kim WM & Lee GH 2015)와 블루베리 천연발효종을 이용한 빵의 특성 연구(Choi SH 2013, Choi SH 등 2014), 쌀 천연발효종을 첨가한 빵의 특성연구(Choi SH & Lee SJ 2014)로 연구가 많지 않으며 국내산 베리류 생산이 증가하는 시점에서 국내산 베리류를 활용하기 위한 연구는 매우 미흡한 실정이다.

일부 업체에서 베리류를 활용한 천연 발효종 제조시 베리류와 함께 발효 영양원으로 설탕, 탈지분유를 첨가하여 발효종을 제조하고 있으나 레시피가 표준화 되어 있지 않아 서로 다른 레시피를 사용하고 있다.

따라서 본 연구에서는 국내 재배량이 급증한 아로니아를 활용하여 우리 환경에 맞는 독특한 풍미를 가지는 천연 발효빵 제조에 적합한 젖산균과 효모가 증식할 수 있는 발효종을 개발하기 위해 반응표면 분석법을 활용하여 아로니아 천연발효종의 최적 레시피를 확립하고자 한다.


Ⅱ. 재료 및 방법
1. 실험 재료

천연 발효종 제조에 사용할 아로니아는 전라북도 고창군에서 재배된 열매를 농가에서 구입하여 50°C에서 건조한 후 냉동보관하면서 사용하였다. 설탕은 시판되는 정백당(CJ Cheiljedang, Ulsan, Korea)을 분유는 시판되는 전지분유(Seoulmilk, Seoul, Korea)를 사용하였다.

2. 반응표면분석 조건

아로니아 천연발효액의 실험 계획, 분석, 최적화 분석은 Design Expert 9 프로그램(Stat-Easy Co., Minneapolis, MN, USA)을 사용하여 반응표면 실험계획법(response surface methodology)의 중심합성디자인에 따라 설계하였다. 천연발효액의 조성(아로니아 함량, 설탕 함량, 분유 함량)을 Table 1과 같이 각각 독립변수로 하고 실험결과인 pH, 산도, 당도, 색도, 생균수, 발효팽창력은 반응변수로 설정하였다. 아로니아 천연발효액의 최적 발효조건을 조사하기 위해 ANOVA test 및 회귀분석을 이용하였고 F-test로 model의 적합성 여부의 유의성을 검증하였으며, 변수들 사이의 상관관계분석을 실시하였다. Pertubation plot와 response surface 3D plot을 이용하여 각 성분들에 대한 반응패턴을 알아보았다.

Table 1. 
Variations and their levels of central composition design for aronia naturally fermented starter
Variable (%) Symbol Coded variable
-2 -1 0 1 2
Dried aronia X1 4 12 20 28 36
Sugar X2 0.5 4 7.5 11 14.5
Dried whole milk X3 0 4 8 12 16

모형의 최적화는 각 반응에 대한 최소 또는 최대 제한점을 결정하였고 입력하였을 때의 가능한 범위에서 그래프가 중첩되는 부분으로 구하였다.

3. 아로니아 천연발효액 제조

아로니아 천연발효액은 효모와 젖산균의 증식을 촉진시키기 위한 영양원으로 설탕, 분유를 증류수에 용해시킨 후 건조된 아로니아를 혼합하여 26°C에서 80 rpm으로 4일간 교반배양(WiseCube WIS-10R, Daihan Sceintific Co., Wonju, Korea)한 후 체에 걸렀다. 아로니아 천연발효액은 위 반응표면 실험계획법에 따라(Table 1) 16가지 조건으로(Table 2, Table 3) 제조하여 분석에 사용하였다.

Table 2. 
Responses for physicochemical properties of fermented starters under various conditions of dried aronia (X1), sugar (X2), dried milk (X3) and their responses
Treatment Variable1) Response
Dried
aronia
(X1)
Sugar
(X2)
Dried
milk
(X3)
pH
(Y1)
Total titratable
acidity
(Y2)
Sugar brix
(Y3)
L
(Y4)
a
(Y5)
b
(Y6)
1 -1 -1 -1 3.48±0.08 0.35±0.04 8.15±0.07 58.08±0.77 17.67±5.54 19.28±11.61
2 -1 -1 1 4.53±0.08 0.34±0.01 10.33±0.04 43.56±1.32 12.64±2.14 21.88±1.76
3 -1 1 -1 3.41±0.13 0.60±0.01 10.03±0.04 48.10±6.57 27.54±2.06 13.55±2.76
4 -1 1 1 3.43±0.04 0.59±0.05 18.48±0.11 52.24±7.78 8.50±3.10 18.71±2.56
5 1 -1 -1 3.57±0.09 0.63±0.03 8.30±0.14 32.73±4.62 38.05±3.17 27.13±7.88
6 1 -1 1 4.07±0.01 0.47±0.01 10.90±0.00 31.71±2.38 23.13±3.81 20.03±1.24
7 1 1 -1 3.37±0.10 0.47±0.06 10.13±0.04 35.87±1.41 36.26±2.39 18.94±3.96
8 1 1 1 4.00±0.09 0.35±0.01 12.04±0.01 34.67±2.39 23.82±0.24 20.40±2.03
9 0 0 0 3.77±0.07 0.51±0.07 9.83±0.04 34.98±10.41 29.72±4.71 19.22±5.51
10 0 0 0 3.69±0.02 0.53±0.02 10.48±0.18 43.63±2.02 20.43±0.97 18.43±0.29
11 -2 0 0 3.97±0.02 0.38±0.01 11.28±0.04 61.96±1.10 5.43±1.02 12.34±1.92
12 2 0 0 3.72±0.10 0.52±0.03 16.80±0.07 30.44±0.01 32.55±1.68 22.71±1.21
13 0 -2 0 4.72±0.01 0.37±0.07 7.10±0.07 36.04±0.84 22.45±3.23 18.56±0.78
14 0 2 0 3.48±0.11 0.50±0.00 18.63±0.18 43.95±7.34 24.17±5.78 17.59±0.48
15 0 0 -2 2.95±0.06 0.74±0.05 11.55±0.07 74.32±3.95 43.46±4.88 7.51±0.17
16 0 0 2 4.46±0.06 0.43±0.03 14.03±0.04 37.92±7.61 15.51±6.91 19.88±3.04
1) Coded variables.

Table 3. 
Responses for viable cell counts and leavening volume under various conditions of dried aronia (X1), sugar (X2), dried milk (X3) and their responses
Treatment Variable1) Response2)
Dried aronia
(X1)
Sugar
(X2)
Dried milk
(X3)
Lactic acid bacteria (Y7) Yeast (Y8) Leavening volume
(Y9)
Before After Before After
1 -1 -1 -1 1.03±0.06 2.25±0.07 1.03±0.08 4.81±0.13 5.00±0.00
2 -1 -1 1 1.15±0.08 6.38±0.08 1.11±0.11 4.54±0.38 22.50±3.54
3 -1 1 -1 0.92±0.04 2.73±0.32 0.93±0.15 4.56±0.41 27.50±3.54
4 -1 1 1 0.85±0.08 2.75±0.35 1.15±0.09 3.69±0.26 0.00±0.00
5 1 -1 -1 1.09±0.07 4.14±0.04 1.16±0.06 3.40±0.15 0.00±0.00
6 1 -1 1 1.11±0.01 7.95±0.07 1.22±0.07 6.05±0.07 102.50±3.54
7 1 1 -1 1.04±0.03 3.20±0.28 0.97±0.05 2.85±0.21 20.00±0.00
8 1 1 1 1.10±0.02 8.27±0.02 1.25±0.16 6.11±0.15 27.50±3.54
9 0 0 0 0.93±0.02 5.34±0.03 1.21±0.22 3.87±0.04 25.00±0.00
10 0 0 0 0.99±0.08 6.47±0.46 1.19±0.15 2.55±0.07 27.50±3.54
11 -2 0 0 1.03±0.10 3.02±0.03 1.23±0.08 3.53±0.17 0.00±0.00
12 2 0 0 1.08±0.03 4.61±0.01 1.08±0.16 5.72±0.14 10.00±0.00
13 0 -2 0 1.10±0.04 5.47±0.13 1.09±0.13 2.59±0.12 5.00±0.00
14 0 2 0 1.05±0.07 5.77±0.27 1.11±0.08 2.57±0.05 32.50±3.54
15 0 0 -2 0.81±0.08 1.95±0.07 1.13±0.12 4.44±0.22 0.00±0.00
16 0 0 2 0.83±0.06 3.96±0.06 0.92±0.11 3.54±0.05 57.50±3.54
1) Coded variables.

4. 천연발효액의 이화학적 특성 측정
1) pH 측정

천연 발효액의 pH는 pH meter(SevenEasy pH, Mettler Toledo AG, Schwerzenbach, Switzerland)로 3회 반복 측정하여 평균값으로 나타내었다.

2) 적정 산도

천연발효액의 적정 산도는 시료의 pH가 8.3이 될 때까지 0.1 N NaOH(Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan)를 소비한 양을 젖산으로 환산하여 산도를 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복 실시하여 평균값을 구하였다.

젖산(mg/100 g)= 0.009×0.1 N NaOH(mL)×F×100/sample (g)

3) 당도

당도는 휴대용 당도계(PAL-1, Atago, Tokyo, Japan)를 사용하여 3회 반복 측정 후 평균값으로 나타내었다.

4) 색도

색도는 시료 채취 후 분광측색계(CR-5, Minolta Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였고, 각 시료의 L(명도), a(적색도), b(황색도)값을 3회 측정하여 평균값으로 나타내었으며, 표준색은 L, a, b값이 각각 98.90, -0.12, -0.27인 백판을 사용하였다.

5. 천연발효액의 젖산균 및 효모 균수 측정

천연발효액을 4일간 배양한 후 1 mL를 취하여 생리식염수(0.85% NaCl) 9 mL와 혼합한 후 시료를 단계적으로 희석한 다음 균수를 측정하였다. 젖산균은 Lactobacilli MRS agar(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에 접종하여 37°C에서 48시간 배양하고 효모균은 yeast extract-peptone-dextrose agar(YPD, Difco Laboratories)를 사용하여 25°C에서 48시간 배양하였다. 배양된 콜로니 수는 30-300개인 희석배수에서 계수한 후 시료 1 mL당 log CFU/mL로 산출하였다.

6. 천연발효액의 발효팽창력 측정

배양된 아로니아 천연발효액으로 다음과 같이 천연발효종을 제조하였다. 아로니아 천연발효액 10 g, 강력분 10 g, 소금 0.2 g을 혼합하여 교반배양기(Daihan Sceintific Co.)에 넣어 26°C에서 12시간 동안 배양한 후 강력분 20 g, 물 20 g, 소금 0.4 g을 추가 혼합하여 6시간 배양하였다. 여기에 강력분 60 g, 물 60 g, 소금 1.2 g을 혼합하여 3시간 더 배양하여 천연발효종으로 사용하였다. 천연발효종 100 g을 채취한 후 반죽을 둥글게 만들어 500 mL 메스실린더에 넣어 매 시간마다 발효(30°C, 상대습도 80%) 팽창된 부피를 mL로 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.

7. 균주 분리 및 동정

천연발효액 중 효모와 젖산균이 가장 많이 확인된 시료를 선발하여 YPD 및 MRS agar 배지에서 미생물을 각 20균주씩 분리하였다.

분리된 미생물 동정은 16s ribosomal RNA 염기서열 분석으로 하였으며, 분석은 ㈜솔젠트(Daejeon, Korea)에 의뢰하였다. PCR 및 sequencer는 각각 ABI 9700 PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)과 ABI 3730XL DNA analyzer(Applied Biosystems)가 사용되었다. 분석된 미생물의 16sRNA 염기서열은 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool을 이용하여 동정 결과 값을 나타내었다.


Ⅲ. 결과 및 고찰
1. 천연발효액의 이화학적 특성
1) pH

아로니아 천연발효액의 pH를 측정한 결과는 Table 2와 같이 2.95-4.72의 범위를 나타냈다. pH는 linear 모델이 선택되었으며 p-value가 0.0003으로 유의적인 결과를 나타냈다(Table 4). 발효액의 조성 중 설탕 함량이 증가할수록 pH는 유의적으로 감소하였고 분유 함량이 증가할수록 pH는 유의적으로 증가하였다. Chung HC(2008)는 반죽의 pH는 발효가 진행됨에 따라 젖산균에 의해 산이 생성되어 pH가 감소하였으며 부재료의 혼합으로 인해 pH가 증가되었다고 보고하였고, Moon SW & Park SH(2008)는 반죽의 pH는 첨가된 물과 영양원의 종류, 원료의 성분 등에 영향을 받는다고 하였다.

Table 4. 
Polynomial equations calculated by RSM program for recipe of naturally fermented aronia
Response Polynomial equation R2 F-value P-value
pH +3.79-0.042X1-0.49X2+0.65X3 0.7790 14.10 0.0003
Total titratable acidity +0.51+0.04X1+0.06X2-0.11X3-0.39X1X2-0.13X1X3+0.02X2X3-0.07X12-0.085X22-0.065X32 0.9372 9.96 0.0056
Sugar brix +11.75+0.68X1+4.51X2+2.51X3 0.5896 5.75 0.0113
L +43.76-16.26X1+2.58X2-10.68X3 0.6632 7.88 0.0036
a +23.83+13.64X1+1.01X2-13.42X3 0.8708 26.96 <0.0001
Lactic acid bacteria +4.64+1.58X1-0.40X2+2.13X3 0.4914 9.59 0.0381
Leavening volume +22.66+14.38X1+(9.163×10-16)X2+26.88C-27.5X1X2+60.0X1X3-70.0X2X3 0.7867 5.53 0.0117

2) 적정 산도

아로니아 천연발효액의 산도를 측정한 결과는 Table 2와 같았다. 천연발효액의 산도는 0.34-0.74의 범위를 나타냈고 quadratic 모델이 선택되었으며 p-value가 0.0056으로 유의적인 결과를 나타냈다(Table 4). Pertubation plot과 반응표면 곡선을 살펴본 결과, 분유 함량이 증가할수록 산도가 낮아졌으며 설탕 함량이 증가할수록 산도가 유의적으로 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 1).


Fig. 1. 
Pertubation plots and response surface plots for physical properties of naturally fermented aronia.

Bing DJ 등(2014)은 머루 발효액의 발효시간이 증가할수록 pH는 감소하고 적정산도가 증가하였으며 머루 발효액으로 제조한 사워도우 첨가량이 증가함에 따라 산도가 증가하였다고 보고하여 아로니아 천연발효액도 반죽 제조시 산도에 영향을 줄 수 있음을 알 수 있었다. 블루베리 쌀 발효액에서도 같은 결과를 보고하였고 발효액의 pH와 적정산도의 변화는 배양하는 동안 미생물에 의해 발효되면서 생성된 젖산과 초산 등 여러 가지 산의 생성과 관계가 있을 것이라고 하였다(Choi SH 2013, Choi SH & Lee SJ 2014). 이번 연구결과에서도 위 보고들과 같이 설탕은 발효원으로써 함량이 높을수록 산 생성량이 증가되어 산도를 증가시켰음을 확인하였으며, 분유 첨가시에는 유단백 성분이 완충작용에 의해 산도에 영향을 준 것으로 추측하였다.

3) 당도

아로니아 천연발효액의 당도는 Table 2와 같이 7.10-18.63 °Brix였다. 당도는 linear 모델이 선택되었으며 p-value가 0.0113으로 유의적인 결과를 나타냈다(Table 4). 발효액 제조에 사용된 설탕 농도가 높을수록 발효액의 당도는 높은 값을 유지하였다(Fig. 1).

발효액에 첨가되는 당은 발효가 진행되는 동안 미생물에 의해 이용되므로 발효액에서 당도는 감소된다. Bing DJ 등(2014)도 머루 발효액의 당도가 발효시간이 증가할수록 유의적으로 낮아졌다고 하였으며 Kim SY(2012)도 당분을 이용해 미생물이 발효되므로 당도는 감소하고 pH는 낮아지며 산도가 증가하였다고 보고하였다.

본 실험에서도 발효가 진행되는 동안 발효액의 당도가 감소되었고 산도는 증가하였으나, 실험 설계시 발효에 필요한 당의 최적 농도 이상의 함량으로 발효액을 제조함에 따라 첨가한 설탕 함량이 과량인 경우, 발효에 사용되고 남은 당이 존재하여 당도가 높게 측정되었다.

4) 색도

아로니아 발효액의 색도는 Table 2와 같이 명도(L) 값은 31.71-74.32, 적색도(a) 값은 5.43-43.46, 황색도(b) 값은 7.51-27.13의 범위를 나타냈다. 명도는 linear 모델이 선택되었으며 p-value가 0.0036으로 유의적인 결과를 나타냈다(Table 4). 발효액 제조에 사용한 아로니아와 분유 함량이 증가함에 따라 발효액의 명도는 유의적으로 감소하였다. 적색도도 linear 모델이 선택되었으며 p-value가 0.0001 미만으로 유의적인 결과를 나타냈다(Table 4). 아로니아 함량이 증가함에 따라 적색도가 증가하였고 분유 농도가 증가함에 따라 적색도는 감소하였다. 아로니아 천연발효액의 황색도는 linear 모델이 선택되었으나 p-value가 0.05로 발효액 조성이 황색도에 유의적인 영향을 주지는 않았다. 아로니아는 특유의 붉은색을 가지고 있어 첨가량에 따라 명도, 적색도에 영향을 주며 분유의 함량이 천연 발효액의 색도에 영향을 주었음을 알 수 있었다.

2. 천연발효액의 젖산균 및 효모 균수 측정

자연 효모를 이용하는 사워도우는 발효에 관여하는 미생물에 의해 주로 영향을 받으며, 특히 젖산균과 효모가 주 발효 미생물로서 발효에 작용하는 것으로 알려져 있다(Corsetti A 등 1996, Gobbetti M 1998). 따라서 아로니아 천연 발효액에서도 젖산균과 효모가 주요 작용을 하는 것으로 판단되어 천연 발효액의 젖산균 및 효모 균수를 측정하였으며 결과는 Table 3과 같았다. 젖산균수는 발효종 조성에 따라 발효 전 0.81-1.15 log CFU/mL에서 발효 후 1.95-8.27 log CFU/mL로 증가하였고, 발효종의 젖산균 수는 linear 모델이 선택되었으며 p-value가 0.0381로 유의적인 결과를 나타냈다(Table 4). 발효액 제조시 첨가한 아로니아와 분유 함량이 증가할수록 젖산균 수가 증가하였다(Fig. 2). Sieuwerts S 등(2018)은 사워도우 발효시 젖산균인 Lactobacillus plantarum과 효모는 포도당과 과당, 유당만 탄소원으로서 활성화되었다고 보고하였다. 본 실험에서도 분유에 함유된 유당이 젖산균이 증식하는데 필요한 좋은 영양원이 되어 젖산균 증가에 영향을 주었다고 생각된다.


Fig. 2. 
Pertubation plots and response surface plots for lactic acid bateria and leavening volume of naturally fermented aronia.

효모 균수는 Table 3과 같이 발효 전 0.92-1.25 log CFU/mL에서 발효 후 2.55-6.11 log CFU/mL로 증가하였으며 발효종의 효모균수는 quadratic 모델이 선택되었고 아로니아와 분유 함량이 증가할수록 효모가 증가하는 경향은 보였으나 p-value가 0.4575로 유의적이지는 않았다. Lee JY 등(2003)의 연구결과에서도 제빵용 천연발효종에 당류, 염류 영양원을 첨가함에 따라 젖산균수는 크게 증가하였으나 효모의 증가는 미미하였고 올리고당 첨가시에는 오히려 감소하였으며, 수분함량에 따라 젖산균 생장이 촉진되어 효모에 대한 영양원이 고갈되고 pH 저하에 의해 효모의 생장이 억제되었다고 보고하였다. Chung HC(2008)도 사워도우 첨가 반죽에서 젖산균의 산 생성으로 인한 pH 저하로 효모의 증식을 감소시켰다고 보고하였다. 본 연구에서도 발효의 진행에 따라 유산균이 생산한 산과 아로니아에 함유된 유기산이 효모의 생장에 영향을 주었다고 생각하였다.

3. 천연발효액의 젖산균 및 효모 균주 분리 및 동정

아로니아 천연발효액 시료 중 젖산균 및 효모가 가장 많이 확인된 8번 시료에 대해 효모 및 젖산균을 각각 20 균주를 분리하여 16s RNA 염기서열 분석을 통해 미생물을 동정하였다.

분리된 균주의 염기서열 동정 결과 효모 20 균주 모두 Saccharomyces cerevisiae로 확인되었으며, 젖산균 20균주 모두 Enterococcus faecium으로 확인되었다.

천연 발효빵 제조와 관련하여 probiotics로 Enterococcus 속, Lactobacillus 속 등이 사용되고 있다. S. cerevisiae는 제빵 효모로 스타터 균주로 가장 많이 사용되고 있으며, E. faecium은 장질환에 예방을 주는 균으로 알려져 있다(Chae DJ 등 2011a, Chae DJ 등 2011b).

최근 빵 제조시 효모인 S. cerevisiae 뿐만 아니라 E. faecium와 혼합 제조하여 기능성이 부여된 빵 제조 연구가 활발해지면서 본 연구에서 분리된 미생물인 S. cerevisiaeE. faecium은 빵 제조시 발효용 균주로 사용 가능성이 있는 것으로 사료된다.

4. 아로니아 천연발효액의 발효팽창력 측정

아로니아 천연발효액과 강력분으로 반죽을 제조한 후 발효팽창력을 측정한 결과는 Table 3과 같았다. 12시간 발효 후 팽창된 반죽의 부피는 0-102.5 mL였으며 2FI model이 선택되었고(Table 4), p-value가 0.0117로 유의적인 차이가 있었다. Pertubation plot과 반응표면 곡선을 보면 분유 함량이 증가할수록 발효팽창력이 유의적으로 증가하였다(Fig. 2).

발효팽창력은 발효시 생성되는 CO2 가스에 영향을 받으며(Chae DJ 등 2011a), 발효종의 산도는 글루텐 구조에 영향을 주어 빵의 부피와 노화에 영향을 줄 수 있다(Flander L 등 2011). 본 연구 결과에서도 젖산균과 효모에 의해 생성된 CO2 가스에 의해 팽창이 일어난 것으로 생각되며 아로니아 자체에 함유된 유기산과 발효과정에서 생성된 산(Table 2)이 글루텐 구조에 영향을 주어 발효팽창력에 영향을 주었을 것이라고 생각하였다.

5. 아로니아 천연발효액의 배합비 최적화

아로니아 천연발효액의 배합비 최적화를 위해 아로니아(4-36%), 설탕(0.5-14.5%), 분유(0-16%)의 비율을 달리하여 이화학적 특성 및 생균수, 발효팽창력을 측정하여 제빵적성 측면에서 최적화를 하고자 하였다.

수치 최적을 예측하기 위해 이화학적 특성 중 유의적이었던 산도, 당도, 색도, 젖산균, 발효 팽창력에 대해 독립변수인 아로니아, 설탕, 분유의 범위 내에서 최소 혹은 최대로 설정하고, 모델화로 결정된 반응식에 따라 변수에 대해 만족하는 점 중에서 최고의 적합성을 나타낸 최적점을 예측하였다. 이를 통한 각 독립변수의 예측된 최적 값은 아로니아 19.72%, 설탕 12.44%, 분유 1.95%이었다(Fig. 3, Fig. 4).


Fig. 3. 
Pertubation plot and response surface for optimization on desirability of the naturally fermented aronia.


Fig. 4. 
Overlay plots of the common area for the optimizing the the naturally fermented aronia.

6. 천연 발효 조건과 반응변수 사이의 상관관계

아로니아 천연발효액의 원료인 아로니아, 설탕, 분유와 반응변수인 pH, 적정 산도, 당도, 색도, 젖산균수 및 효모 균수, 발효팽창력 값 사이의 상관관계(p<0.05)를 분석한 결과(Table 5), 아로니아 함량은 적정 적색도, 황색도와 양의 상관관계가 있었고 명도와 음의 상관관계가 있었다. 설탕 함량은 적정산도, 당도와 양의 상관관계가 있었고, pH와 음의 상관관계가 있었으며, 분유 함량은 pH와 젖산균, 발효팽창력과 양의 상관관계가 있었고 적정산도, 명도와 적색도와는 음의 상관관계가 있었다.

Table 5. 
Coefficients table on the independent and responsible variables of the recipe of naturally fermented aronia
Dried aronia Sugar Dried milk
pH -0.0425 -0.4900** 0.6525***
Total titratable acidity 0.04 0.0600* -0.1150**
Sugar brix 0.6775 4.5075** 2.5125
L -16.255** 2.5775 -10.675*
a 13.6437*** 1.0088 -13.4163***
b 4.2275* -2.3325 3.3575
Lactic acid bacteria 1.5788 -0.3963 2.1313*
Yeast 0.6488 -0.2038 0.3713
Leavening volume 14.3750 9.16×10-16 26.875**
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.


Ⅳ. 요약 및 결론

본 연구에서는 천연발효 빵 제조를 목적으로 기능성 베리류로 알려진 아로니아를 천연 발효종으로 이용하기 위해 반응표면분석법을 이용하여 천연발효액의 조성을 최적화하고자 하였다. 천연발효액의 최적 조성확립을 위해 중심합성계획법에 따라 독립변수인 아로니아 비율(4-36%), 설탕 첨가량(0.5-14.5%), 분유 첨가량(0-16%)을 달리하여 실험을 계획하였고 발효액의 특성을 반응변수로 하여 분석한 후 발효액 조성을 최적화하였다. 반응표면 분석결과 천연 발효액 원료의 예측된 최적값은 아로니아 19.72%, 설탕 12.44%, 분유 1.95%이었다. 천연 발효액의 주 원료인 아로니아는 열매 자체의 특성에 따라 발효액의 색도와 같은 이화학적 특성에 영향을 주었고 설탕과 분유는 적정산도, pH, 당도, 색도, 젖산균수와 발효 팽창력에 영향을 주므로 발효 특성에 영향을 주는 중요 인자임을 알 수 있었다. 또한 아로니아 천연발효액종의 주된 미생물은 Saccharomyces cerevisiaeEnterococcus faecium으로 확인되었다. 이상의 연구 결과로 아로니아과 같은 기능성 베리류는 특유의 색과 풍미가 있어 천연발효종으로서 가치가 우수하며 분리된 미생물을 이용하여 기능성 천연발효빵 제조에 활용할 수 있을 것이라고 생각된다.


Acknowledgments

This research was supported by Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture, Forestry (IPET) through High Value-added Food Technology Development Program, funded by Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA)(316069-03).

Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.


References
1. An, HL, Heo, SJ, Lee, KS., (2009), A study on the properties of sourdough starters using Korean wheat, Korean J Culin Res, 15(4), p37-46.
2. Bing, DJ, Kim, WT, Chun, SS., (2014), Development of white bread using fermented wild grape sourdough, J Korean Soc Food Sci Nutr, 43(12), p1896-1905.
3. Chae, DJ, Lee, KS, Jang, KH., (2011a), Sourdough and bread properties utilizing different ratios of probiotics and yeast as starters, Korean J Food Sci Technol, 43(1), p45-50.
4. Chae, DJ, Lee, KS, Jang, KH., (2011b), Effect of amount of probiotics and yeast as starter on quality characteristics of sourdough bread, J Korea Acad-Ind Coop Soc, 12(6), p2652-2659.
5. Choi, SH, Ko, SJ, Lee, SB, Kim, HS., (2014), Quality characteristics of Korean wheat bread prepared with naturally fermented blueberry-rice starter and purple rice flour, J East Asian Soc Diet Life, 24(6), p883-895.
6. Choi, SH, Lee, SJ., (2014), Quality characteristics of Korean wheat bread prepared with substitutions of naturally fermented rice starters, Korean J Culin Res, 20(2), p100-119.
7. Choi, SH., (2013), Quality characteristics of Korean wheat bread prepared with substitutions of naturally fermented blueberry starters, J East Asian Soc Diet Life, 23(5), p546-560.
8. Chung, HC., (2008), Properties of sourdough-added bread, Korean J Food Sci Technol, 40(6), p643-648.
9. Corsetti, A, Gobbetti, M, Smacchi, E., (1996), Antibacterial activity of sourdough lactic acid bacteria: Isolation of a bacteriocin like inhibitory substance from Lactobacillus sanfrancisco C57, Food Microbiol, 13(6), p447-456.
10. Danaka, KB., (1994), Science of baking process, Kwang Lim Publisher, Tokyo, Japan, p151-158.
11. Flander, L, Suortti, T, Katina, K, Poutanen, K., (2011), Effects of wheat sourdough process on the quality of mixed oat-wheat bread, LWT-Food Sci Technol, 44(3), p656-664.
12. Gasiorowski, K, Brokos, B, Tabaka, H., (2000), Evaluation of the immunomodulatory activity of four compounds exerting antimutagenic effects on human lymphocytes in vitro, Cell Mol Biol Lett, 5(4), p469-481.
13. Gobbetti, M., (1998), The sourdough microflora: Interactions of lactic acid bacteria and yeasts, Trends Food Sci Technol, 9(7), p267-274.
14. Hong, JH, Kim, KJ, Bang, KS., (2000), Effect of sourdough starter on the characteristics of rheological of barley bread, Korean J Soc Food Sci, 16(4), p358-362.
15. Hong, JH, Kim, KJ., (2001a), Effect of prepared by Enterococcus sp. and Lactobacillus sp. on the quality of barley bread, I. Identification of bacterial strain from barley power and rheological properties of sourdough. Korean J Diet Cult, 16(4), p354-360.
16. Hong, JH, Kim, KJ., (2001b), Effect of barley bread using sourdough prepared by Enterococcus sp. and Lactobacillus sp, II. Physicochemical and rheological properties of barley bread. Korean J Diet Cult, 16(4), p361-370.
17. Hwang, ES, Lee, YJ., (2013), Quality characteristics and antioxidant activities of Yanggaeng with aronia juice, J Korean Soc Food Sci Nutr, 42(8), p1220-1226.
18. Kim, SY., (2012), A study on the quality characteristcs of pan bread added with GABA rice bran sourdough, Master's thesis, Yeungnam University, Kyungsan, Korea, p13-16.
19. Kim, WM, Lee, GH., (2015), Comparison of imported wheat flour bread making properties and Korean wheat flour bread making properties made by various bread making methods, J Korean Soc Food Sci Nutr, 44(3), p434-441.
20. Lee, JY, Lee, SK, Cho, NJ, Park, WJ., (2003), Development of the formular for natural bread-making starter, J Korean Soc Food Sci Nutr, 32(8), p1245-1252.
21. Lee, YK, Park, IK, Kim, SD., (2001), Effect of lactic acid bacteria related to kimchi fermentation on the quality of bread, J East Asian Soc Diet Life, 11(5), p379-385.
22. Moon, SW, Park, SH., (2008), Quality characteristics of white pan bread with Chungkukjang powder, J Korean Soc Food Sci Nutr, 37(5), p633-639.
23. Ohgami, K, Ilieva, I, Shiratori, K, Koyoma, Y, Jin, X, Yoshida, K, Kase, S, Kitaichi, N, Suzuki, Y, Tanaka, T, Ohno, S., (2005), Anti-inflammatory effect of aronia extract on rat endotoxininduced uveitis, Invest Ophthalmol Vis Sci, 46(1), p275-281.
24. Oszmianski, J, Wojdylo, A., (2005), Aronia melanocarpa phenolics and their antioxidant activity, Eur Food Res Technol, 221(6), p809-813.
25. Sieuwerts, S, Bron, PA, Smid, EJ., (2018), Mutually stimulating interactions between lactic acid bacteria and Saccharomyces cerevisiae in sourdough fermentation, LWT, 90, p201-206.
26. Wu, X, Gu, L, Prior, RL, Mckay, S., (2004), Characterization of anthocyanins and proanthocyanidins in some cultivars of Ribes, Aronia, and Sambucus and their antioxidant capacity, J Agric Food Chem, 52(26), p7846-7856.