The Korean Journal of Food and Cookery Science
pISSN 2287-1780 l eISSN 2287-1772 l KOREAN

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Korean Journal of Food & Cookery Science - Vol. 33 , No. 4

[ Article ]
Korean Journal of Food & Cookery Science - Vol. 33, No. 4, pp.380-386
ISSN: 2287-1780 (Print) 2287-1772 (Online)
Print publication date 31 Aug 2017
Received 14 Jun 2017 Revised 18 Jun 2017 Accepted 06 Jul 2017
DOI: https://doi.org/10.9724/kfcs.2017.33.4.380

브로콜리 표면 미생물 계수와 미생물 군집 분석을 위한 시료 처리 방법
김민수 ; 박은진1,
경희대학교 생물학과
1제주대학교 식품생명공학과

Methods for Viable Cell Counts and Community Analysis of Microbial Populations on Broccoli
Min-Soo Kim ; Eun-Jin Park1,
Department of Biology, Kyung Hee University, Seoul 02447, Korea
1Department of Food Bioengineering, Jeju National University, Jeju 63243, Korea
Correspondence to : Eun-Jin Park, Department of Food Bioengineering, Jeju National University, 102 Jejudaehak-ro, Jeju-si, Jeju Special Self-Governing Province 63243, Korea Tel: +82-64-754-3612, Fax: +82-64-755-3601, E-mail: ejpark@jejunu.ac.kr


© 2017 Korean Society of Food and Cookery Science
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Abstract
Purpose

This study examined methods for viable cell counts and microbial analysis of leaf surfaces of broccoli.

Methods

For analysis of microbial cell counts on the leaf surfaces of vegetables including broccoli, we performed physical homogenization using a stomacher with cell separation using ultrasound.

Results

In the comparison of cell separations using a stomacher and ultrasound, no significant differences in total bacterial and fungal cells were found in all treated samples (p>0.05). The amount of megagenomic DNAs of broccoli leaf-associated microbiota were not significantly different over time in the ultrasonic wave (p>0.05). The number of sequences assigned to bacteria was different in two different primer sets. There was no significant difference in total cell counts of bacteria and fungi on broccoli leaves collected from 10 local farms and 10 grocery stores in Seoul and Jeju Island.

Conclusion

These results suggest that ultrasonic treatment for 5-10 min is a suitable method to determine viable cell counts and community analysis of broccoli.


Keywords: broccoli, Brassica oleracea L. Italica group, ultrasound, microbial cell count, 16S rRNA gene amplification

Ⅰ. 서 론

최근 들어 건강에 대한 관심이 높아지면서 최소가공식품이나 자연식품의 수요가 증가하고 있다. 특히 채소류에는 비타민, 무기질, 그리고 식이섬유 등이 풍부하여 가열조리와 가공을 하지 않고 신선한 상태로 섭취하게 되면 영양소의 생리활성이 유지되는 효과가 있다(Shim WB 등 2015). 또한 채소류의 잎 표면은 미생물 군집의 주요한 서식지이며, 채소류의 섭취를 통하여 인체의 장관 기관으로 유입되는 미생물은 건강에도 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다. 채소나 과일 등 농산물에 존재하는 미생물은 재배하는 동안 기온, 토양, 습도, 일조량과 관개용수 등의 외부 환경 요인에 의해 성장과 유입이 영향을 받는다(Padaga M 등 2000). 뿐만 아니라, 채소류 표면 구조 역시 미생물 군집에 영향을 미친다. 상대적으로 복잡한 구조를 가진 배추와 양상추 등이 매끄러운 표면의 파와 토마토 등보다 미생물 서식이 용이하며 제거가 어렵다(Park EJ 등 2008). 특히 브로콜리와 양파 등의 채소는 짧은 수확기간 후 다음 수확까지 1년 동안 저장하면서 소비하기 때문에 수확 시 표면에 존재하는 미생물이 저장기간 동안 증식 또는 오염되어 그 위험성이 증가하는 경향도 관찰되고 있다(Warriner K 등 2009).

브로콜리(broccoli, Brassica oleracea L. Italica group)는 최근 우리나라에서도 소비가 크게 증가하였다. 브로콜리는 지상으로부터 50-80 cm 정도 자란 줄기의 끝에 녹색 꽃눈이 빽빽하게 나면서 꽃봉오리(floret)를 이룬다. 이 꽃봉오리의 지름이 12-15 cm 정도 자라면 수확한다. 브로콜리는 9-10월경에 파종하여 12월에서 다음해 3월까지 수확한다. 이 꽃봉오리가 저장 중 클로로필이 분해되어 노란색으로 변하기 시작하고 조직이 연화되면서 악취가 발생하면 부패가 시작되었음을 의미한다(Ceponis MJ 등 1987). 노란색으로 변하는 것은 에틸렌(ethylene)을 생산하는 미생물의 존재 때문일 것으로 추측하며, 악취는 지방분해효소를 가진 미생물이 지방산 산화를 일으켜 발생하는 것으로 알려져 있다(Fukuda H 등 1993). 또한 조직이 연화되는 것 또한 미생물이 원인이 되어 다양한 과일과 채소의 부패를 일으키는 것으로 알려져 있다(Zhuang H 등 1994).

브로콜리의 부위별 미생물 수를 연구한 Padaga M 등(2000)은 브로콜리를 균질기로 분쇄하여 배양 후 그 미생물 수를 확인하였다. Mohd-Som F 등(1995)은 수확기 브로콜리에 최고 106 CFU/g의 미생물 수가 존재함을 확인하였다. Padaga M 등(2000)은 브로콜리 품종과 저장 온도, 그리고 부위에 따라 102-104 CFU/g의 미생물 수를 나타낸다고 보고하였다. 이 연구들은 모두 브로콜리 조직을 분쇄한 후 배양을 통하여 확인한 결과이다. 배양을 통하여 브로콜리 표면에 존재하는 것으로 확인된 Pseudomonas 속(genus) 등의 미생물은 저장 중 증식하여 후기 미생물 조성의 대부분을 차지하면서 부패를 일으키는 것으로 알려져 있다(Brackett RE 1989). 따라서 수확 후에 온수를 이용한 표면 살균과 공기조성을 변화시킨 저장고에서의 저장 등으로 미생물 증식을 억제하여 그 저장성을 증진시키고자 노력하였다(Zhuang H 등 1994, Forney CF 1995). 브로콜리의 꽃봉오리는 꽃눈이 촘촘하게 모여 있어 세척이 어려운 복잡한 구조를 가지고 있다. 또한 줄기는 두꺼운 반면 꽃봉오리는 상대적으로 부드러워 꽃봉오리에서 부터 부패가 시작된다. 앞서 언급한 바와 같이 브로콜리 부패를 일으키는 미생물은 대부분 꽃봉오리에 존재할 것으로 추측되지만 그 수와 종류에 대한 정확한 연구는 미흡한 실정이다(Brackett RE 1989).

위에서 언급한 내용들을 종합해보면, 브로콜리 표면 미생물에 대한 연구는 브로콜리 전체의 미생물 수 분석, 브로콜리 꽃봉오리와 줄기 각각의 미생물 수 차이 확인, 품종과 저장 온도에 따른 미생물 수 변화 관찰, 표면 미생물 억제 위한 노력, 그리고 영양성분 분해능 등으로 동정(identification)한 군집 결과 등을 보고한 논문이 대부분이다(Fukuda H 등 1993, Mohd-Som F 등 1995, Padaga M 등 2000). 그러나 아직까지 우리나라 브로콜리 연구는 미생물보다는 sulforaphane과 항산화 활성 등의 기능성 물질에 관한 것이 대부분이다(Kwon YD 등 2008, Kim MS & Park EJ 2014). 따라서 우리나라 전체 브로콜리 생산의 대부분을 차지하는 제주의 농장에서 바로 채취한 브로콜리와 슈퍼마켓에서 판매되는 브로콜리, 재배 지역과 품종이 다른 브로콜리 등에 대한 연구가 수행되어야 하며, 총 미생물 생균수 확인뿐만 아니라 최신 미생물 동정 기법인 미생물의 유전자 분석을 통한 보다 자세한 브로콜리 미생물 군집 분석이 필요하다고 판단된다. 이러한 결과를 바탕으로 각각 채소와 과일에 존재하는 미생물 특성에 맞는 제어 방법을 찾기 위한 연구도 수행되어야 할 것으로 판단된다.

본 연구에서는 브로콜리 표면 미생물 측정을 위하여 균질기를 이용한 방법과 초음파를 이용한 방법을 적용한 후 더 적합한 표면 미생물 계수 및 수집 방법을 모색하고자 하였으며, 이를 통하여 확립된 방법으로 농장에서 수확한 브로콜리와 소매점에서 유통 중인 브로콜리 표면 미생물을 배양 의존적인 방법으로 계수하였다. 또한 배양 비의존적인(culture-independent) 미생물 유전자 분석을 위한 메타지놈(metagenome) DNA를 추출하고 primer들로 유전자를 증폭한 후 그 결과를 비교하여 브로콜리를 포함한 채소 시료에 적합한 배양 비의존적인 표면 미생물 군집 분석 방법을 모색하고자 하였다.


Ⅱ. 재료 및 방법
1. 브로콜리 시료

균질기와 초음파 처리 실험 사용된 브로콜리는 제주시내 슈퍼마켓(하나로마트, 제주, 대한민국)에서 구입 후 4°C에 냉장보관하면서 실험에 사용하였다. 미생물 생균수 확인에 사용된 브로콜리는 2014년 12월부터 2015년 3월까지 제주도내 브로콜리 밭에서 직접 채취한 농장 시료와 같은 기간 동안 서울과 제주시내 10곳의 슈퍼마켓에서 구입한 국내산 브로콜리를 시료로 사용하였다. 농장 브로콜리 시료는 제주도 제주시 대정읍과 애월읍에 있는 브로콜리 밭에서 채취하였다. 수확기의 브로콜리는 밭을 삼각형으로 나누어 각 꼭짓점 위치에서 3송이를 채취하여 1개의 시료로 하였다. 총 10개 브로콜리 밭에서 시료를 수집하였다. 판매 브로콜리는 농장 브로콜리와 마찬가지로 3송이 브로콜리를 합하여 1개의 시료로 하였다.

2. 브로콜리에 대한 균질기와 초음파 처리 방법

브로콜리 표면 미생물을 채취하기 위하여 균질기(bagmixer-400VW, Interscience, Saint Nom, France)와 초음파 처리기(Powersonic420, Hwashin Technology, Daegu, Korea)를 이용하였다. 균질기는 1초당 2회 stroke으로 작동하였으며, 초음파는 40 KHz의 주파수에서 처리하였다. 브로콜리 3송이로부터 각각 20 g씩 멸균 칼로 채취하여 1개의 멸균 필름 봉투(Bagfilter-111410, Interscience)에 넣고 여기에 0.1% buffered peptone water(BPW, Difco, Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) 120 mL를 넣은 후 5분, 10분, 20분, 30분, 그리고 40분 균질기와 초음파 처리하였다.

3. 브로콜리 시료의 미생물 분석

각각 처리 시간 후 브로콜리가 침지된 BPW를 잘 혼합하고 이로부터 100 μL를 채취하여 십진희석 후 배지에 도말하였다. 총 세균 수와 총 곰팡이와 효모 수는 각각 tryptic soy agar(TSA, Difco)와 potato dextrose agar(PDA, Difco)를 사용하여 분석하였다. 세균은 37°C에서 24-48시간, 곰팡이와 효모는 20°C에서 72시간 이상 배양하였다. 배양 후 생성된 전형적인 세균, 곰팡이와 효모 colony를 계수하였으며, 이를 log CFU/브로콜리 1 g으로 계산하여 나타내었다.

4. 브로콜리로부터 세균 DNA 추출 및 정량

브로콜리 3송이로부터 각각 20 g씩 멸균 칼로 채취하여 1개의 멸균 필름 봉투(Interscience)에 넣고 여기에 0.1% BPW를 80 mL 넣은 시료를 5개 만든 후 초음파 처리기(Hwashin Technology)에 넣고 5분, 10분, 20분, 30분, 그리고 40분 처리하였다. 초음파 처리를 한 시료액으로부터 미생물을 수집하기 위하여 시료 40 mL를 튜브에 넣고 4°C를 유지하면서 16,000 ×g로 10분 동안 원심 분리하였다. 침전된 펠렛(pellet)은 200 µL 멸균 증류수를 이용하여 수집한 후 DNA 추출에 사용하였다. 총 미생물 DNA 추출은 PowerSoil DNA Isolation Kit(MO-BIO Laboratories Inc., 369 Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 매뉴얼에 따라 실험을 수행하였다.

5. 브로콜리 표면 미생물 16S rRNA 유전자 증폭 및 분석

브로콜리 표면 미생물로부터 추출한 DNA는 세균의 16S rRNA 유전자 염기서열의 hypervariable region 중 V1-V2 region(27F와 338R)과 V5-V6 region(779F와 1115R)을 증폭하는 primer set를 사용하였다(Hamady M 등 2008, Redford AJ 등 2010). PCR 반응은 template DNAs, primer set(0.2 μM), 2×PCR Master Mix Solution(i-TaqTM, iNtRON biotechnology, Korea)을 혼합한 뒤, 다음의 조건에서 반응하였다. 94°C에서 3분간 변성에 이어서 다음 과정을 28번 반복하였다. 94°C에서 15초간 변성, 55°C에서 45초간 primer 결합, 그리고 72°C에서 1분간 신장하였다. 반복 후 마지막으로 72°C에서 8분 동안 반응 후 종료하였다. 각 시료 당 총 4개의 동일한 증폭 유전자를 제조하였으며, QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하여 정제하였다. 모든 시료는 QuantiT Picogreen dsDNA assay kit(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 통해 DNA 양을 측정하였고, 동일 양을 혼합한 뒤 454 pyrosequencing GS FLX Titanium(Roche 454 Life Sciences, Branford, CT, USA)을 통해 그 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 QIIME software package v1.9.0 (Caporaso JG 등 2010)을 통해 분석하였다. 평균값 Q20 미만이거나, 6개 초과 homopolymer를 가지고 있거나, ambiguous base calls을 지니거나, 길이가 200 bp보다 짧은 염기서열은 우선 제외하였다. Denoiser를 통해 염기서열 통합화 과정을 진행한 뒤, reverse primer 부분을 제거하였다. 또한, USEARCH(v7.0)의 UCHIME algorithm을 통해 chimeric sequence를 제거하였다. 이후, 남은 염기서열은 97% 염기서열 상동성을 기준으로 open-reference clustering(SortMeRNA_SUMACLUST)을 통해 OTU(operational taxonomic unit)를 구성하였다. 각 OTU의 대표 염기서열을 추출하고, UCLUST- based taxonomy classifier를 이용하여 Greengenes 데이터베이스와 비교함으로써, 각 OTU의 분류학적 명명을 진행하였다.

6. 통계처리

각각의 실험은 3회 이상의 독립적인 실험을 수행하였으며, 그 결과를 평균±표준편차로 나타내었다. 실험결과는 GraphPad Prism(ver. 5.0 for Windows, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)을 사용하여 one-way ANOVA로 분석하고, Tukey posthoc test로 사후 검정한 후 평균값의 유의차(p<0.05)를 검증하였다.


Ⅲ. 결과 및 고찰
1. 균질기와 초음파 처리에 따른 브로콜리 표면 미생물 수

브로콜리 표면 미생물의 계수를 위하여 브로콜리 전체를 희석액에 넣고 마쇄하여 균질하게 하는 방법과 초음파를 이용하여 브로콜리 표면 미생물만 희석액으로 분리하는 방법을 수행한 후 그 결과를 Fig. 1(총 세균 수)과 Fig. 2(총 곰팡이와 효모 수)에 나타내었다. 균질기의 처리 시간을 최대 20분으로 설정한 이유는 작동 10분 이내에 브로콜리 시료가 충분히 균질하게 되었기 때문이다. 반면에 초음파처리는 시간에 따른 브로콜리 형태 변화가 없기 때문에 시간을 40분까지 설정하여 처리하였다. 균질기 처리 5분, 10분, 20분과 초음파 처리 5분, 10분, 20분, 30분, 그리고 40분에서 모두 유의적인 미생물 생균수 차이를 확인할 수 없었다(p>0.05). 그러나 균질기 처리의 경우에는 시료 간 총 세균 수가 비슷하였지만, 초음파는 처리 10분에서 5.78 log CFU/g으로 최고 수치를 나타냈으며 이후 감소하여 처리 40분에는 5.49 log CFU/g을 나타내었다(p>0.05). 총 곰팡이와 효모 수의 경우에서도 균질기 5분 처리에서는 5.30 log CFU/g을 나타내다 20분 처리에서는 5.04 log CFU/g으로 감소하였고, 초음파 처리에서는 전체 처리 시료에서 5.50 log CFU/g 전후의 생균수를 유지하였다(p>0.05). 이러한 결과는 균질기와 초음파 처리 모두 본 연구에서 선택한 처리시간과 유의적인 상관관계 없이 일정한 미생물 수를 나타내어 미생물 생균 수 측정을 위한 처리방법에 차이를 발견할 수 없었다. 그러나 이후 미생물 군집(community) 분석을 위한 메타지놈 DNA 추출 및 분석을 위해서는 시료 처리 방법과 시간이 DNA 함량에 미치는 영향에 대한 추가적인 고려가 필요할 것으로 판단된다.


Fig. 1. 
Comparisons of total bacterial cells on broccoli by treatment methods (stomacher and ultrasound) and treatment time (p>0.05).


Fig. 2. 
Fig. 2. Comparisons of total fungal cells on broccoli by treatment methods (stomacher and ultrasound) and treatment time (p>0.05).

김치로부터 세균 메타지놈 DNA를 추출하여 16S rRNA 유전자를 증폭한 후 얻은 염기서열을 분석한 논문에서는 진핵생물 영역(eukarya domain)에 해당하는 YuccaBrassica 속 등이 대량 검출되었다고 보고하였다(Park EJ 등 2012). 검출된 Yucca 속도 식물이지만 특히 Brassica 속은 배추 속 식물의 학명으로 세균을 증폭하는 primer가 배추 진핵세포를 증폭하였다는 것을 의미한다. 이는 진핵세포의 18S rRNA 유전자도 16S rRNA를 증폭하는 primer로 증폭이 가능하다는 것이며, 채소류 등의 미생물 군집 분석을 위하여 DNA를 이용하고자 할 때는 채소류 세포의 오염을 방지하는 시료 채취 방법을 사용해야 함을 의미한다(Huys G 등 2008). 배추 진핵세포가 대량 증폭된 Park EJ 등(2012)의 논문에서는 미생물 군집 분석을 위한 시료인 김치를 여러 겹의 거즈로 싸서 압력을 가하는 방법으로 처리하였기 때문에 이 과정에서 배추 세포가 유출된 것으로 추측하였다. 뿐만 아니라 김치에 사용되는 부재료인 마늘과 파, 무 등은 김치에 이용하기 전에 절단과 마쇄의 과정을 거치기 때문에 이로부터도 역시 식물 진핵세포가 유출되었으리라 판단된다. 따라서 브로콜리의 표면 미생물을 배양 의존적인(culture-dependent) 방법으로 분리하고자 할 때는 시료의 처리방법 및 시간 등이 유의적인 영향을 미치지 않지만, 이 시료로부터 미생물 DNA를 추출하여 분석하고자 할 때는 시료를 마쇄하지 않는 방법, 즉 균질보다는 초음파를 이용하는 방법이 적절할 것으로 판단된다. 이를 고려할 때 브로콜리를 초음파로 5분 또는 10분 정도 처리하는 것이 적절할 것으로 생각되지만, 초음파 처리시간이 추출되는 DNA 양에 영향을 주는지에 대한 추가적인 고려가 필요할 것으로 판단되어 이에 대한 실험을 수행하였다.

초음파 처리 5분, 10분, 20분, 30분, 그리고 40분 처리한 브로콜리 시료는 희석액에 표면 미생물이 분리되어 존재하지만 DNA를 추출하기에 농도가 낮기 때문에 이를 원심 분리하여 회수한 침전물로부터 미생물 DNA를 추출하여 그 양을 측정하였다(Fig. 3). 그 결과 모든 처리 시료에서 DNA의 양에 약간의 차이가 있었지만 모두 유의적이지 않은 수치였다(p>0.05). 따라서 본 연구에서는 위의 결과들을 고려하여 브로콜리 표면 미생물 생균수 측정과 DNA 추출을 위한 전처리 조건으로 초음파 처리 10분으로 결정하여 이후 실험에 적용하였다. 초음파는 비열처리 방법으로 액체 내에서 압력파(pressure wave)에 의한 공동현상(cavitation)으로 생성된 기포(bubble)에 의해 원료 표면으로부터 미생물이나 이물질이 분리될 수 있다(Kang SW 등 2014). 그러나 이 생성된 기포가 파열되면서 생성되는 진동 에너지는 미생물 세포벽을 파괴하여 생육을 저해하는 것으로 알려져 있으므로(Ajlouni S 등 2006) 사용 목적에 따른 적절한 처리 시간의 선택이 필요하다. 본 연구에서는 초음파를 5분부터 40분까지 처리하였으며, 40분 처리 후 총 세균 수에 있어서 감소를 나타내었지만 유의성은 관찰되지 않았다(p>0.05). 따라서 본 연구에서 선택한 10분의 초음파 처리는 미생물 사멸이 아닌 표면 미생물을 희석액으로 분리시키는 목적으로 사용하기에 적절한 방법이라 판단하였다.


Fig. 3. 
Fig. 3. Quantification of microbial DNA extracted from broccoli treated with ultrasound using Picogreen dsDNA assay kit (p>0.05).

2. 농장과 소매점 브로콜리 표면 미생물 수

제주도내 10개 브로콜리 밭과 서울과 제주도내 10개 슈퍼마켓에서 구입한 브로콜리 표면 미생물 수를 분석한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 분석을 위한 브로콜리 시료는 앞서 결정한 브로콜리 표면 미생물 수집 방법인 초음파 10분 처리 후 얻은 액체 시료를 사용하였다. 총 세균 수는 밭 브로콜리에서 4.68±1.06 log CFU/g, 슈퍼마켓 브로콜리에서 5.14±1.01 log CFU/g으로 슈퍼마켓 시료의 생균수가 높게 확인되었으나, 유의적인 차이는 나타나지 않았다(p>0.05). 총 곰팡이와 효모 수의 경우도 마찬가지로 밭 브로콜리에서 5.50±1.13 log CFU/g을, 슈퍼마켓 브로콜리에서 5.34±1.06 log CFU/g이었지만 역시 유의적인 차이는 없었다(p>0.05). 브로콜리는 꽃봉오리와 줄기를 함께 채취하며 주로 섭취하는 부분은 꽃봉오리이다. Padaga M 등(2000)의 연구에서는 밭에서 채취한 브로콜리 꽃봉오리 미생물이 줄기보다 10배 이상 많이 존재한다고 보고하였다. 이들의 연구에서는 브로콜리 꽃봉오리와 줄기 표면을 약 3 mm 정도 잘라낸 내부 미생물도 계수하였으며, 표면 미생물이 3 mm 내부 미생물보다 10-100배 높은 수준임을 확인하였다. 또한 브로콜리 품종과 재배 지역, 저장 온도와 기간에 따른 미생물 수의 차이도 확인하였으며, 전체적으로 브로콜리 꽃봉오리에는 103-106 CFU/g의, 줄기에는 102-106 CFU/g의 총 세균을 계수하였다. 총 효모 수 역시 유사한 경향을 나타내어 꽃봉오리에는 103-104 CFU/g의, 줄기에는 102-103 CFU/g의 총 효모를 계수하였다. 본 연구에서는 꽃봉오리와 줄기를 합하여 계수하였으며, 밭 시료에서는 102-106 CFU/g, 슈퍼마켓 시료에서는 103-106 CFU/g의 총 세균 수를 확인하였다. 총 곰팡이와 효모 수는 밭 시료는 103-107 CFU/g, 슈퍼마켓 시료에서는 103-107 CFU/g의 범위를 나타내어 각각 시료의 재배지역 및 저장 환경에 따라 그 수의 범위가 크다는 것을 알 수 있었다. 다른 연구들에서도 신선한 브로콜리의 총 세균 수는 104-106 CFU/g의 범위를, 총 효모 수는 103-105 CFU/g의 범위를 나타낸다고 보고하여 본 연구 결과와 유사함을 알 수 있었다(Brackett RE 1989, Mohd-Som F 등 1995).


Fig. 4. 
Total abundance of bacterial and fungal cells on broccoli collected from local farms and grocery stores (p>0.05).

앞서 언급한 바와 같이, 브로콜리 표면 미생물은 저장 중 증식하여 부패를 일으키며, 이들 미생물은 수확 직전 그 표면에 존재하던 것이다. 또한 수확 단계에서의 표면 미생물은 재배 중 환경에 의해 그 조성이 달라진다. 농장에서 수확한 브로콜리와 슈퍼마켓에서 구입한 브로콜리의 미생물 수의 차이가 크지 않다는 것은 슈퍼마켓까지 이동 및 저장하는 동안 외부로부터의 뚜렷한 미생물 오염은 없는 것으로 추측할 수 있다. 그러나 미생물은 수치에 변화가 없어도 이들 군집을 조성하는 미생물 종류는 끊임없이 변화하기 때문에 군집에 대한 분석이 필요할 것으로 판단된다. 미생물 군집을 분석하기 위해서는 배양 의존적인 방법과 배양 비의존적인 방법이 이용되고 있다. 현재까지 실험실에서 배양을 통하여 이름이 붙여진 세균은 약 1만 여 종에 불과하다. 우리가 알고 있는 세균은 실제 자연계에서 존재하는 세균의 극히 일부분이라고 할 수 있다. 이와 같은 이유로 자연계에 존재하는 세균 중 배양이 가능한 것은 1% 미만으로 추정하고 있다(Park EJ 등 2012). 따라서 현재는 배양 의존적 방법이 아닌 배양 비의존적인 방법을 택하여 그 미생물 조성을 확인하는 연구가 다양한 환경 시료에 적용되고 있으며, 최근에는 김치와 젓갈 등의 식품에 존재하는 미생물 분석에도 적용하고 있다(Park EJ 등 2012, Kim MS & Park EJ 2014).

3. 브로콜리 표면 미생물의 배양 비의존적 분석을 위한 16S rRNA 유전자 증폭 방법 비교

배양 비의존적인 방법 중 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응)은 가장 널리 사용되고 있으며, 세균의 DNA 중 16S rRNA 유전자 등 특정 유전자를 증폭하고 그 유전자 서열을 분석함으로써 군집 조성 및 세균의 종(species) 단위까지의 분석이 가능하다. 따라서 본 연구에서는 배양 비의존적인 방법을 통하여 브로콜리 표면 미생물 조성을 분석하기 위한 예비 실험으로써 두 가지 primer를 이용하여 브로콜리 표면 미생물로부터 추출한 DNA로부터 16S rRNA를 증폭하여, 그 이용 가능성을 확인하고자 하였다.

초음파를 10분 처리하여 얻은 브로콜리 표면 미생물로부터 추출한 DNA에 대하여 두 가지 primer set으로 증폭한 후 유전자 서열을 분석한 결과를 Fig. 5에 나타내었다. 두 가지 primer set은 16S rRNA 유전자의 hypervariable region 중 V1-V2 region(27F와 338R)과 V5-V6 region(779F와 1115R)을 증폭하는 것이다. 16S rRNA 유전자는 9개의 hypervariable region을 가지고 있으며, 해당 region은 공통조상(common ancestor)에 가까울수록 유사하다(Yang B 등 2016). V1-V2 region(27F와 338R)은 interspecies diversity를 반영할 정도의 변이를 반영하고 있는 부분으로, 16S rRNA 유전자를 통한 미생물 군집 분석에서 널리 사용되고 있다(Hamady M 등 2008). V5-V6 region(779F와 1115R)은 식물 유래 chloroplast 16S rRNA gene과의 유사성으로 인한 중복 증폭을 피할 수 있는 부분으로, 식물 공생 미생물체 군집 분석에 사용되고 있다(Redford AJ 등 2010, Leff JW & Fierer N 2013). 분석 결과, V1-V2 region을 증폭하는 primer set(P)에서 다수의 chloroplast 염기서열이 발견되었으며, 특히 농장 시료에서는 90% 이상을 차지하였다. 반면, V5-V6 region을 증폭하는 primer set(N)에서는 chloroplast 염기서열이 1% 미만으로 나타났다. 농장 시료와 슈퍼마켓 시료의 증폭된 염기서열 비율 차이는 추후 심도 있는 분석을 진행한 후 확인할 수 있을 것으로 판단된다. 이를 통해, 배양 비의존적 방법을 통한 브로콜리 표면 미생물 군집에서는 16S rRNA 유전자의 V5-V6 region을 증폭하는 접근법을 통해 효과적인 미생물 탐지가 가능할 것으로 판단한다. 본 연구 결과를 토대로 하여 추후 연구에서는 브로콜리 부패에 주도적 역할을 하는 에틸렌 생성 미생물과 섬유소를 분해하는 효소 생성 미생물 등을 표적으로 하는 유전자 증폭 방법 등을 적용하여 배양으로 분리 및 확인이 어려운 부패 유발 미생물 등의 존재 유무와 그 양을 확인할 수 있을 것으로 판단된다.


Fig. 5. 
Fig. 5. The percentages of chloroplast sequences and bacterial sequences amplified with two different primer sets specific for V1-V2 (P) and V5-V6 (N) regions of 16S rRNA gene on broccoli samples.


Ⅳ. 요약 및 결론

본 연구에서는 브로콜리 표면 미생물 계수 및 군집 분석에 적합한 시료 처리 방법을 모색하고자 하였다. 브로콜리를 포함하는 채소 미생물 계수를 위하여 시료를 마쇄하는 균질기 처리방법과 미생물을 표면으로부터 희석액으로 분리하는 초음파 처리방법을 비교하였다. 총 세균 수와 총 곰팡이와 효모 수에 있어서 균질기 5분, 10분, 20분과 초음파 5분, 10분, 20분, 30분, 그리고 40분 처리 후 유의적인 차이를 발견할 수는 없었다. 그러나 브로콜리 미생물로부터 메타지놈 DNA를 분리하기 위해서는 브로콜리 진핵세포가 함께 추출되는 균질기 사용 보다는 표면 미생물만 분리할 수 있는 초음파 처리 방법이 적합할 것으로 판단된다. 또한 초음파 처리 시간에 따라 추출된 브로콜리 미생물 메타지놈 DNA 양에서도 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 따라서 브로콜리 표면 미생물 분석을 위해서는 초음파 처리 5-10분 처리가 적절할 것으로 판단된다. 제주도내 브로콜리 농장 10곳과 서울과 제주도내 슈퍼마켓 10곳으로부터 수집한 브로콜리 시료의 총 세균 수와 총 곰팡이와 효모 수는 농장 시료에서 약간 높았으나 유의적인 차이는 없었다. 또한 배양 비의존적 방법을 통해 브로콜리 표면 미생물 검출 비율을 비교해 보니, 미생물 군집 분석에 널리 사용되는 16S rRNA 유전자의 V1-V2 region 보다는 V5-V6 region을 증폭하는 방법이 식물 chloroplast 염기서열의 중복 증폭을 피해 미생물 검출 비율을 효과적으로 높이는 것으로 나타났다. 본 연구에서 확인된 브로콜리 미생물 분석을 위한 시료 처리 방법을 이용하여 추후에는 미생물의 분리 및 추출한 메타지놈 DNA로부터 브로콜리 부패를 유발하는 미생물 특이적인 유전자 확인 등의 연구가 수행되어 이를 바탕으로 브로콜리의 안전성 확보 및 저장성을 증진을 위한 연구가 수행되어야 할 것으로 판단된다.


Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.


Acknowledgments

This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Science, ICT & Future Planning (NRF-2014R1A1A1003104).


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